A história do anime se passa em um "Japão feudal futurístico e pós-apocalíptico", onde aquele que conseguir a bandana simbólica de "Número Um", irá comandar o mundo, como um "deus". Alguem se torna o Número Um matando o antigo Número Um e tomando sua bandana. Entretanto, somente aquele que tiver a bandana de "Número Dois" tem direito de desafiá-lo. Quando criança, Afro teve seu pai (que era o Número Um) assassinado bem em sua frente por um pistoleiro, "Justice" (antigo Número Dois) e este passou a ser o Número Um. Agora Adulto, Afro Samurai, é o atual Número Dois, e viaja pelo mundo em busca de vingança, pelo atual Número Um que matou seu pai.
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